Mots-Clés

Flagelline, Grippe porcine, Single Cell RNAseq, Machine learning, immunité inné

Description

Description de la problématique de recherche

La filière porcine est confrontée à la menace croissante que représentent les maladies infectieuses animales. Le virus de la grippeporcine A (swine influenza A virus / SIAV) prédispose les animaux au complexe de la maladie respiratoire porcine, causant d'énormespertes économiques dans le monde entier. Il s'est avéré difficile de réduire la menace de ce maladie par des moyens de prévention, carles vaccins actuels contre le SIAV ne permettent pas d'obtenir une immunité stérilisante et une protection croisée. La stimulation del'immunité innée par la flagelline, un agoniste du TLR5 et un modulateur du système immunitaire inné, est apparue comme unestratégie alternative prometteuse pour augmenter la résistance aux maladies. Nous avons précédemment montré que l'administrationde flagelline déclenche l'expression de gènes antiviraux chez le porc et protège contre l'infection par la grippe chez la souris, ce quisuggère que la flagelline pourrait également renforcer la défense immunitaire contre le SIAV chez le porc. Cet effet bénéfique peut êtreattribué à une activité pro-inflammatoire transitoire de la flagelline et à son effet positif sur la maturation des cellules immunitaires. Les objectifs de ce projet de thèse sont les suivants : (i) fournir une compréhension complète des interactions moléculaires et cellulaireshôte-virus qui sont modulées par la flagelline ; (ii) fournir la preuve de concept de l'activité protectrice de la flagelline contre l'infectionpar le SIAV chez les porcs. Nous combinerons l'imagerie confocale, le séquençage de l'ARN dans des cellules uniques (scRNA-seq) etles approches d'édition de gènes pour déchiffrer la complexité des réponses du porc aux infections par le SIAV et les mécanismes deprotection induits par la flagelline. Nous espérons identifier les gènes et les voies qui sont des moteurs essentiels de la réponseantivirale de l'hôte au SIAV. Des essais fonctionnels (utilisant des systèmes de culture cellulaire knockout CRISPR-Cas9) seront utiliséspour valider ces candidats. En définitive, ce projet contribuera à l'élaboration de stratégies de prévention et de contrôle plus efficaces etplus sûres pour lutter contre les infections virales chez les porcs.

Contexte

Le virus de la grippe porcine A (SIAV) est l'un des principaux agents pathogènes viraux du complexe des maladies respiratoiresporcines (PRDC) [1]. Le virus est très contagieux et infecte la majeure partie du troupeau affecté. En plus, le SIAV peut prédisposer leporc à des infections respiratoires secondaires par des bactéries pathogènes. SIAV est également menaçant pour la santé humaine enraison de son potentiel zoonotique [2,3]. Le développement de nouvelles solutions ciblant cet agent pathogène s'inscrit dans le cadred'une stratégie mondiale 'Une seule santé'. Cependant, c'est avant tout le secteur porcin qui bénéficiera directement de toutdéveloppement réussi dans ce domaine. En France, ce secteur produit plus de 2 millions de tonnes de viande de porc, soit la troisièmeplus grande production en Europe.

Le virus de la grippe porcine A (SIAV) infecte les voies respiratoires des porcs, se répliquant principalement dans les cellulesépithéliales, mais aussi dans d'autres types de cellules, y compris les cellules immunitaires. L'infection entraîne l'activation des facteursde transcription NF-κB et IRF3/7, la production d'interférons de type I et de cytokines pro-inflammatoires [4,5]. Afin d'échapper à laréponse immunitaire, SIAV bloque l'activation d'IRF3 par l'action de la protéine non structurale NS1 [6]. D'autre part, le rôle de NF-κBdans la réponse cellulaire à l'infection par le SIAV est discuté, car il régule à la fois des voies anti et pro-virales [7]. La stimulation del'immunité innée par la flagelline, ligand de TLR5, a démontré des activités protectrices dans des modèles de maladies bactériennes(chez le porc) et virales, y compris la grippe et l'infection pneumococcique post-influenza (chez la souris) [8]

Objectifs

Les études définissant la réponse de l'hôte à l'infection par le virus de la grippe sont principalement fondées sur des analyses depopulations cellulaires, ce qui ne rend pas compte de la complexité des voies respiratoires infectées ni de l'hétérogénéité de la réponsecellulaire au virus de la grippe. Les technologies de séquençage unicellulaire permettent désormais d'explorer l'hétérogénéité de laréponse cellulaire à l'infection par le SIAV. L'objectif global de ce projet de thèse est d'identifier les déterminants cellulaires etmoléculaires impliqués dans la pathogenèse du SIAV et les mécanismes utilisés par la flagelline pour moduler la réponse de l'hôte auvirus. Les questions de recherche abordées par le doctorant sont : (i) Comment l'infection par le SIAV module-t-elle la dynamiqued'activation de NF-κB et IRF3 et la réponse inflammatoire cellulaire ? (ii) La stimulation de la flagelline protège-t-elle contre l'infectionpar le SIAV et comment ?

Méthode

Dans un premier temps, nous allons évaluer l'effet de la flagelline sur les cellules infectées par le SIAV in vitro. La lignée cellulaire épithéliale bronchique porcine T3 sera infectée par différentes souches de SIAV et traitée ou non par la flagelline. Nous allonscaractériser la dynamique de l'activation de NF-κB et IRF3, les altérations de la fonction mitochondriale et la réponse immunitaire innéealtérée par PCR quantitative microfluidique. Ensuite, nous évaluerons l'effet protecteur de la flagelline contre l'infection par le SIAV invivo et les 'signatures' ARN monocellulaires en réponse au SIAV et à la flagelline. Des algorithmes d'apprentissage automatique etd'intelligence artificielle seront utilisés pour identifier les déterminants clés de l'infection et de la protection par la flagelline. Noussélectionnerons un sous-ensemble de gènes (jusqu'à 10 gènes) identifiés par nos données et validerons leur rôle dans l'infection par leSIAV (approche CRISPR-Cas9).

Résultats attendus

Nous avons obtenu des résultats préliminaires suggérant que la flagelline est capable de recruter des cellules immunitaires dans lespoumons des porcs, ainsi que de déclencher l'expression de certains gènes antiviraux chez le porc. Dans le modèle murin, nous avonsconstaté que la flagelline protège contre la grippe. L’utilisation de technologies d'ARNseq à l'échelle des cellules uniques permettrad'améliorer notre compréhension des mécanismes utilisés par le SIAV au cours de l'infection pulmonaire et d'identifier les facteurs clésqui déterminent l'infection virale et la virulence. En plus, nous apporterons la preuve de concept que l'administration de flagellineprotège contre le SIAV chez les porcs et nous déterminerons les mécanismes de la protection médiée par la flagelline contre le SIAV.

Références bibliographiques

1 Schmidt, C. et al. Swine Influenza Virus and Association with the Porcine Respiratory Disease Complex in Pig Farms in SouthernBrazil. Zoonoses Public Health 63, 234-240, doi:10.1111/zph.12223 (2016).
2 Deblanc, C. et al. Mycoplasma hyopneumoniae does not affect the interferon-related anti-viral response but predisposes the pig to ahigher level of inflammation following swine influenza virus infection. J Gen Virol 97, 2501-2515, doi:10.1099/jgv.0.000573 (2016).   

3 Salvesen, H. A. & Whitelaw, C. B. A. Current and prospective control strategies of influenza A virus in swine. Porcine Health Manag 7,23, doi:10.1186/s40813-021-00196-0 (2021).
4 Schmitz, M. L., Kracht, M. & Saul, V. V. The intricate interplay between RNA viruses and NF-kappaB. Biochim Biophys Acta 1843,2754-2764, doi:10.1016/j.bbamcr.2014.08.004 (2014).
5 Steuerman, Y. et al. Dissection of Influenza Infection In Vivo by Single-Cell RNA Sequencing. Cell Syst 6, 679-691 e674,doi:10.1016/j.cels.2018.05.008 (2018).
6 Talon, J. et al. Activation of interferon regulatory factor 3 is inhibited by the influenza A virus NS1 protein. J Virol 74, 7989-7996,doi:10.1128/jvi.74.17.7989-7996.2000 (2000).
7 Droebner, K. et al. Pharmacodynamics, Pharmacokinetics, and Antiviral Activity of BAY 81-8781, a Novel NF-kappaB Inhibiting Anti-influenza Drug. Front Microbiol 8, 2130, doi:10.3389/fmicb.2017.02130 (2017).
8 Georgel, A. F. et al. Toll-like receptor 5 agonist flagellin reduces influenza A virus replication independently of type I interferon andinterleukin 22 and improves antiviral efficacy of oseltamivir. Antiviral Res 168, 28-35, doi:10.1016/j.antiviral.2019.05.002 (2019).

Précisions sur l'encadrement

L'étudiant sera co-encadré par Ignacio Caballero (Directeur de thèse) et Sascha Trapp (co-encadrant, sascha.trapp@inrae.fr), UnitéINRAE UMR1282 ISP, équipe 3IMo pour le suivi de la formation doctorale et pour l'avancement des recherches. De plus, un comité depilotage interne INRAE sera mis en place (1 réunion par an).

Conditions scientifiques matérielles et financières du projet de recherche

Les principaux matériaux requis pour le projet sont déjà présents dans notre laboratoire ou sont accessibles grâce à notre réseau decollaborateurs. Des stocks de grippe porcine (A/Swine/Bissendorf/IDT1864/2003, H3N2) et des lignées cellulaires, y compris plusieursclones de cellules épithéliales bronchiques porcines fonctionnellement immortalisées, sont disponibles dans notre laboratoire. Lasouche H3N2-Bissendorf est un isolat clinique provenant d'un porc en détresse respiratoire et a été précédemment utilisée par notreéquipe pour des études d'infection in vitro et in vivo. D'autres souches de grippe porcine, par exemple des isolats de souches H1N1 ouH1N2 circulant actuellement, peuvent être obtenues auprès de l'Unité de Virologie et d'Immunologie Porcine (VIP) du Laboratoire dePloufragan-Plouzané-Niort (ANSES). Microscope confocal, Chromium 10X pour scRNA-seq, lecteur de plaques Tecan Spark pour lesexpériences de criblage à haut débit par fluorescence et luminescence, machines de qPCR en temps réel, machine de qPCRmicrofluidique (Fluidigm / Biomark HD), et cytomètres de flux multi-laser sont tous accessibles dans notre unité et notre personnel a étéformé pour utiliser ces équipements. Le PFIE est présent sur place pour réaliser des infections in vivo par la grippe porcine. . Nousavons des collaborations de longue date et en cours avec JC Sirard, qui fournit la flagelline, et P Barbry (IPMC, Nice) pour effectuerl'analyse scRNA-seq.
Méthodes : Toutes les méthodes utilisées dans ce projet sont déjà optimisées et réalisées de manière routinière dans le laboratoire.Des protocoles RT-qPCR à moyen débit (réseaux Fluidigm et pipelines bio-informatiques pour l'analyse des données) ont été mis aupoint pour suivre l'expression des gènes cellulaires et des gènes viraux dans des cellules aviaires et porcines. Des méthodes demicroscopie confocale permettant de suivre la translocation de NF-κB et IRF3 au niveau de la cellule unique à l'aide d'ImageJ et de CellProfiler ont été récemment publiées par notre laboratoire. Toutes les techniques virologiques appliquées dans le projet (titrage duvirus, analyse de la charge virale par RT-qPCR) sont des protocoles standard bien établis dans le laboratoire.
Nous avons aussi déjà obtenu un financement para l'institut Carnot France Future Elevage pour prendre en charge tous les coûts de ce projet.

Objectifs de valorisation des travaux de recherche du doctorant : diffusion, publication et confidentialité,droit à la propriété intellectuelle,...

Le projet de thèse donnera lieu à la publication de 2-3 articles scientifiques dans des journaux internationaux à comité de lecture. Ladiffusion des résultats et des publications sera effectuée au sein de l'INRAE et au niveau national et international (via congrès, site web,Twitter). Les travaux développés dans le cadre de ce projet peuvent conduire au développement d'un brevet pour l'application demolécules immuno-stimulatrices afin de stimuler la réponse immunitaire des poumons.

Profil et compétences recherchées

Nous recherchons un étudiant (ou une étudiante) curieux, motivé, appréciant le travail d'équipe mais sachant aussi faire preuved'autonomie et d'esprit critique. Une formation en programmation (Python, R) serait très appréciée. Une expérience précédente destage de laboratoire et avec les techniques de culture cellulaire, et/ou de biologie moléculaire (qPCR) serait un plus. Il est important desouligner que le projet de doctorat nécessite des expérimentations animales.